賽默飛 QuantStudio 5 熒光定量 PCR 儀操作規(guī)程

一、目的

為確保賽默飛 QuantStudio 5 實時熒光定量PCR儀的正確使用，提高實驗效率，確保實驗數(shù)據(jù)的準確性和重復性，特制定本操作規(guī)程。該規(guī)程適用于分子生物學、基因表達分析、核酸檢測等相關(guān)實驗中的PCR檢測工作。

二、適用范圍

本規(guī)程適用于使用賽默飛 QuantStudio 5 實時熒光定量PCR儀進行核酸擴增和熒光定量檢測的實驗操作人員。適用場景包括科研實驗室、醫(yī)療檢測機構(gòu)、食品和環(huán)境檢測單位等。

三、儀器簡介

QuantStudio 5 是賽默飛生命科學儀器平臺推出的一款實時熒光定量PCR設(shè)備，具備96孔與384孔兩種格式版本。該儀器配置靈敏的熒光檢測系統(tǒng)和高精度溫控模塊，配套Design and Analysis軟件進行數(shù)據(jù)處理和可視化分析，支持多種應(yīng)用場景。

主要技術(shù)參數(shù)：

• 檢測通道：最多支持6個熒光通道

• 熒光染料兼容性：FAM、SYBR Green、VIC、ROX、Cy5 等

• 樣品通量：96孔（0.2 mL）或384孔板

• 溫控精度：±0.25℃

• 升降溫速率：最大4.0℃/秒

• 最小檢測體積：10 μL（推薦），5 μL為限

• 光學系統(tǒng)：獨立激發(fā)和發(fā)射濾光片，快速濾片切換

• 軟件平臺：QuantStudio Design and Analysis 軟件

• 數(shù)據(jù)輸出格式：Excel、PDF、CSV等

四、使用準備

1. 儀器開機檢查

• 打開主機電源，檢查設(shè)備狀態(tài)燈是否正常（綠色為正常）

• 確保計算機與主機通過USB或局域網(wǎng)連接

• 啟動QuantStudio軟件，登錄用戶賬戶

• 檢查樣品艙是否干凈，無液體殘留或雜質(zhì)

• 確保熒光濾光片和溫控板無損傷、無污染

2. 實驗準備

• 準備反應(yīng)體系，包括引物、探針、酶、緩沖液及模板核酸

• 樣本混勻后加樣至PCR板或試管中，封板并輕輕離心去除氣泡

• 樣本總量建議控制在10–20 μL，確保PCR反應(yīng)效率

• 使用推薦的光學透明封板膜，避免熒光信號干擾

3. 模板與耗材管理

• 使用專用PCR板（0.2 mL）和光學封板膜

• 樣本添加順序應(yīng)按照軟件設(shè)定模板進行，確保板位與樣本對應(yīng)

• 樣品編號應(yīng)統(tǒng)一命名，便于后續(xù)分析追蹤

• 若實驗涉及多個通道檢測，確保熒光染料無交叉干擾

五、操作流程

1. 實驗設(shè)置

• 打開軟件，點擊“新建實驗"

• 選擇實驗類型（定量PCR、熔解曲線分析、相對定量等）

• 選擇熒光染料和檢測通道，匹配實驗方案

• 設(shè)定PCR擴增程序，如：

• 95℃ 15秒

• 60℃ 60秒（熒光采集）

• 初始變性：95℃ 10分鐘

• 擴增循環(huán)（40 cycles）：

• 設(shè)定板圖：將樣本、陰性對照、陽性對照、標準品標注至對應(yīng)孔位

• 保存方法模板文件，便于重復使用

2. 加載樣品與運行

• 打開儀器樣品艙，將96孔PCR板平穩(wěn)放置在加熱模塊上

• 關(guān)閉樣品艙蓋，確保均勻受熱

• 點擊“開始運行"按鈕，系統(tǒng)將執(zhí)行程序并實時采集數(shù)據(jù)

• 實驗過程中可查看擴增曲線，監(jiān)測熒光信號變化

3. 實驗完成與數(shù)據(jù)分析

• 實驗結(jié)束后，系統(tǒng)自動生成Ct值表格和擴增圖

• 可進行標準曲線分析、基因表達比值計算、熔解曲線分析等

• 可導出數(shù)據(jù)報告，包括Ct值、擴增效率、圖表等格式

• 根據(jù)需求保存為PDF、Excel或圖像文件，進行后續(xù)統(tǒng)計分析

4. 實驗結(jié)束后的處理

• 移除PCR板并按廢物處理流程處置

• 用干凈棉簽或無塵紙巾清潔加熱模塊表面

• 關(guān)閉軟件與主機，切斷電源，蓋好防塵罩

• 核查實驗記錄，補充試劑使用情況與樣本處理信息

六、注意事項

1. 實驗期間盡量避免樣品艙打開，防止溫控系統(tǒng)紊亂

2. PCR板應(yīng)均勻加樣，避免氣泡產(chǎn)生或液體溢出

3. 使用專用熒光染料，勿自行替換未驗證的染料

4. 實驗過程中應(yīng)佩戴防護手套，避免污染反應(yīng)體系

5. 所有樣本及耗材使用后應(yīng)規(guī)范處置，防止污染環(huán)境

6. 每次使用前應(yīng)檢查儀器狀態(tài)，出現(xiàn)異常及時聯(lián)系維修人員

7. 盡量使用模板文件，提高操作一致性與數(shù)據(jù)可比性

七、常見問題與處理

八、維護與校準

1. 日常維護

• 每次使用后進行外觀清潔

• 保持儀器通風口暢通，防止過熱

• 檢查電源線、USB或網(wǎng)絡(luò)連接狀態(tài)

2. 定期校準

• 光學系統(tǒng)與溫控模塊應(yīng)根據(jù)廠商推薦周期進行校準

• 可使用賽默飛提供的校準板進行自檢

• 校準應(yīng)由具備資格的人員或廠家技術(shù)支持人員執(zhí)行

• 記錄每次校準與維護結(jié)果，備查

九、安全與應(yīng)急處理

• 實驗操作遵守生物安全規(guī)定，使用生物安全柜處理高風險樣本

• 熒光染料避免直接接觸皮膚和眼睛

• 如遇試劑泄漏，立即使用70%乙醇或漂白劑進行清理

• 設(shè)備發(fā)生電氣故障時，立即斷電并通知相關(guān)技術(shù)人員處理

• 實驗過程中如發(fā)現(xiàn)異常升溫或煙霧，應(yīng)立即停止運行并檢查電源系統(tǒng)

十、附錄：推薦PCR反應(yīng)體系（以20 μL為例）